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RNA PULL DOWN

RNA PULL DOWN
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胞质蛋白的提取:

1、细胞消化下来预冷得 PBS 洗两遍, 2000rpm 离心 4min 。

2、 500?l cold lysis buffer重悬沉淀,冰浴 10min 。

3、 5000rpm 离心 5min , 4°C 。上清为胞浆蛋白,沉淀为胞核部分。

4、 将上清收集至另一 EP 管, 500?l lysis buffer重悬沉淀, 冰浴 10min , 5000rpm 离心 5min ,

4°C ,弃沉淀,即得到胞核蛋白。

5、若需同时用胞浆及胞核蛋白,将二者等体积混合即可。

胞核蛋白的提取:

1、 收细胞, PBS 洗一遍。

2、 2ml PBS+2ml nuclear isolation buffer+6ml 水重悬细胞,冰浴 20min 。

3、 离心, 2500g/4度 /15 min,弃上清。

4、 1ML RIP buffer(加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。

5、 超声破碎细胞 25个循环左右。

6、 13000rpm 离心 10min ,弃沉淀。

RNA Pulldown

1、 体外转录 (Biotin RNA Labeling Mix、 T7 RNA polymerase ) , 大约两小时 (至浑浊) 。

2、 DNase I 处理 15分钟。

3、 RNA 纯化(RNeasy Mini Kit) 。

4、 3ug RNA, 90度热击, 2min 。冰上, 2min 。

5、 加入 RNA structure buffer。

6、 转入室温, 20min 。

7、 将折叠好的 RNA 与蛋白混合,室温孵育 1h 。

8、 每个样中加入 60ul 洗过的磁珠,室温孵育 1h 。

9、 洗五次。

10、加入 SDS buffer,煮沸,进行 WB 鉴定。

cold lysis buffer:(胞质蛋白提取裂解液 ) RNA structure buffer:

1mM PMSF 10 mM Tris pH 7.0 20units Rnasin 0.1 M KCl

10mM Tris-HCl pH 7.4 10 mM MgCl2

10mM NaCl

3mM MgCl2

0.1mM DTT

0.5% NP40

RIP buffer:(胞核蛋白裂解液) nuclear isolation buffer (核提取液) : 150 mM KCl 1.28 M sucrose

25 mM Tris pH 7.4 40 mM Tris-HCl pH 7.5

0.5 mM DTT 20 mM MgCl2

0.5% NP40 4% Triton X-100

1 mM PMSF

protease Inhibitor

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