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核酸染色剂

核酸染色剂
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电泳后,核酸需经染色才能显色出带型,常用以下核酸染色剂:

1.溴化乙锭(ethidium bromide, EB)最常用的核酸荧光染料,这种扁平分子可嵌入核

酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出桔红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面,一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭,二是结合在DNA分子中的EB本身,主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量,来源于这两方面的能量,最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。 EB-DNA 复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍,因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深,可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min,使非结合的EB褪色,这样可检查到10ng的DNA样品, EB也可用于检测单链DNA或RNA,但其对单链核酸的亲和力相对较小,荧光产率也相对较低。在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB,染色可在电泳过程中进行,能随时观察核酸的迁移情况,这种方法使用于一般性的核酸检测。但EB带正电荷,嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性,使迁移率减慢,故不宜用于测定核酸分子量的大小,这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解,应于4℃避光保存。

2.吖啶橙(acridine orange,AO):吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间,在254nm紫外

线激发下发出530nm的绿色荧光;还通过静电与单链核酸的磷酸基结合,在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸,灵敏度分别为0.1μg 和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格,应在 22℃,0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)中避光浸泡30min,然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3.银(Ag+)试剂: Ag+与核酸形成稳定复合物,然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3

等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链,双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右,比亚甲蓝染色高100~1000倍,在小于0.5mm厚的凝胶中,能检测出0.5ng的 RNA,其缺点是专一性不强,能与蛋白质,去污剂反应也产生褐色,而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合,对DNA有破坏作用,不适于DNA 片段回收的制备。

4.亚甲蓝(methylene blue):可将RNA染成蓝色,但灵敏度不高,而且操作时间长。

染色过程:胶浸泡于0.02%的亚甲蓝,10mmol/L Tris-Ac(pH8.3),4℃放置1~2h,用净水洗5-8h(反复换水),带型肉眼可见,最低检测量为 250ng。

5.Gold View Ⅰ型核酸染色剂与溴化乙锭:Gold View是一种可代替溴化乙锭(EB)的新

型DNA燃料,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光,而单链DNA成红色荧光。通过小鼠皮下注射实验,尚未发现Gold View有致癌作用,而溴化乙锭(EB)是一种强致癌剂。因此用Gold View代替EB不失为一种明智的选择。

实验操作步骤:100mL溶胶液在微波炉中融化,冷却至60℃左右(不烫手)后加入10vL Gold View,轻轻摇匀后倒胶,待胶完全凝固后上样电泳,电泳完毕在紫外灯下观察。

注意事项:

1)胶厚度不要超过0.5cm,胶太厚会影响检测灵敏度

2)加入Gold View的琼脂样凝胶反复融化可能会对DNA检测的灵敏度产生一定影响,但不

明显。

3)Gold View在pH 3.6-7.0之间能更好的与核酸结合,因此电泳时最好使用新鲜的电泳

缓冲液。

4)由于Gold View产生绿色荧光,因此不适合于用一般单色胶卷拍照,可以使用凝胶成像

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