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免疫组化染色操作步骤

免疫组化染色操作步骤
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免疫组织化学染色原理和操作步骤

一、免疫组织化学原理

免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针,检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PAP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ABC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(SP)法。

PAP法一抗和二抗均不标记,避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体,与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物(含3个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本,最后用H2O2和二氨基联苯(DAB)为底物显示过氧化物酶,即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸,可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合,从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白,与生物素有很高的亲合力,1分子亲合素可结合4分子生物素,ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合,制成ABC复合物,并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后,再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。

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